胺碘酮促进小鼠心房肌细胞热处理诱导的凋亡炎

房性快速性心律失常是一组临床上常见的快速性心律失常，包括心房颤动、心房扑动、房性心动过速，药物治疗效果不满意，并发症严重。近年来经导管射频消融（RF）已成为房性快速性心律失常治疗的有效手段之一，原理是通过电极释放能量产生高温引起组织的热损伤，阻断异常电位的传导。术后复发是目前房性快速性心律失常特别是心房颤动治疗中存在的主要问题。房颤导管消融的基石是肺静脉电隔离（PVI）［1-2］，研究表明房颤消融术后复发的主要原因是肺静脉和心房之间电传导的恢复［3-4］，这归咎于消融点未实现连续透壁损伤［5］，组织学研究表明不完全的PVI消融区的心肌损伤程度与房颤术后复发率有负相关性［6］。连续线性消融对提高房性快速性心律失常的治疗成功率尤为重要［7-8］。目前提高RF效率的研究主要着眼于物理材料及技术的更新，而RF的操作是通过点与点连接形成消融线，点与点之间的组织因未接受足够的热量易造成亚致死性损伤，导致留有消融“间隙”或后期传导恢复［9］，仅通过物理方法做到电位被完全隔离阻断仍存在困难。

胺碘酮是一种常用的Ⅲ类抗心律失常药，在临床上常被用于控制节律，在射频消融围手术期作为辅助用药可预防和治疗房颤［10］，有研究表明术前应用胺碘酮可减少RF完成PVI的消融点数［11］。本团队前期一项前瞻性临床研究表明，射频消融术中经导管灌注胺碘酮溶液可有效提高术中肺静脉电隔离效率和窦律转复率，降低术后复发率［12］。

既往文献报道，RF造成的组织热损伤主要为高热造成的坏死以及凋亡和炎症［13］。然而，胺碘酮在RF中对心房肌细胞损伤的影响尚无研究报道。研究胺碘酮对受热损伤后的心房肌细胞的作用对探明其是否能促进消融病变从而提高房性心律失常的消融效率具有重要意义。本研究拟建立不完全射频消融的细胞模型，胺碘酮加以干预，初步探索热处理对心房肌细胞的损伤作用，及胺碘酮对心房肌细胞热损伤的影响。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

小鼠HL1心房肌细胞（永诺生物）；HWS-20恒温水浴箱（江苏太仓市实验设备厂），盐酸胺碘酮（Amiodarone）注射液（赛诺菲）；细胞活性检测试剂盒（MTS）G3580、超氧化物歧化酶（SOD）S0101试剂盒、丙二醛（MDA）S0131试剂盒（碧云天）；小鼠白介素1β（IL-1β）ELISAKit、小鼠白介素6（IL-6）ELISAKit、小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISAKit（武汉华美生物）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HL-1心房肌细胞在含10%胎牛的Dulbecco改良版Eagle培养基（DMEM）中进行培养，培养基含10%血清（FBS，Gibco）和1%青霉素-链霉素（Invitrogen），置于37°C、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.2 热处理 参考Yoshida等［14］的肝脏射频消融体外模型方法，水浴热诱导小鼠HL1心房肌细胞，体外模拟射频消融术中亚致死的心房肌细胞。当HL1小鼠心房肌细胞生长至80%汇合时，通过胰蛋白酶消化，洗涤并在1.5 mL微量离心管中用1 mL含10%FBS的DMEM重悬细胞（5×104）并立即在温度37、46、49、52、55、58 ℃的恒温水浴箱中培养10 min，然后将细胞接种到含10%FBS的100 μLDMEM中的96孔培养板中（1×104/孔），继续在37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h，MTS法测量吸光度显示存活率，得出对比于37 ℃细胞活力降低25%的温度，数据用于后续实验。

1.2.3 药物干预 先用盐酸胺碘酮注射液与DMSO配成100 mmol/L的母液，HL-1心房肌细胞接种于96孔板，待细胞汇合度到80%时，分别加入不同剂量的胺碘酮母液滴定至浓度为0、3、10、30、60、90 μmol/L，在37 ℃恒温水浴箱中持续1 h，继续在37 ℃，5%CO2下培养12 h，用MTS法测量吸光度，得出对比于无药物（0 μmol/L）时细胞活力降低25%的药物浓度，此浓度用于后续实验。

1.2.4 实验分组 HL1心房肌细胞按前述1.2.1的方法培养并接种至96孔培养板（1×104/孔）后按下列方式分组：空白对照组：置于37 ℃恒温水浴箱；热处理组：置于1.2.2选出的温度水浴箱；胺碘酮组：滴定至实验1.2.3所选的胺碘酮浓度再立即置于1.2.2选出的温度水浴箱，3组细胞均置于相应水浴箱10 min后继续在37 ℃、5%CO2下复温培养12 h进行后续指标测定。

1.2.5 MTS检测细胞活性 3个实验组细胞接种于96孔板，每组设置3 个复孔，加入5 mg/mL 的MTS 溶液（20 μL/孔），室温孵育4 h，弃孔内培养液，加入DMSO（150 μL/孔），放入振荡仪匀速振荡15 min，采用酶标仪检测波长为490 nm处各孔的吸光度A490nm，计算细胞存活率。

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，采用0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤细胞3次，调整细胞密度至2×106/mL，细胞悬液转移至离心管，4 ℃，1000 r/min离心10 min，弃上清，加入预冷PBS重悬细胞，相同条件下离心10 min，PBS 洗涤，加入200 μL Binding Buffer，分别加入5 μLAnnexin V-FITC与PI充分混匀，室温避光孵育15 min，加入300 μL Binding Buffer，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡率。

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